Metodo raccomandato per le pratiche diagnostiche e di valutazione della suscettibilità che prevede l'impiego di una serie di provette contenenti il terreno di coltura (brodo di Mueller-Hinton) vengono aggiunte diluizioni scalari (in ragione di 2) dell’antibiotico da saggiare.
C'è un gruppo di studiosi che decide di allestire questo schema. C'è uno studio molto lungo anche di qualche anno durante il quale deve saggiare una serie di geni housekeeping, abbiamo visto 7 geni ma uno parte da 20-30 geni facendo uno studio pilota li compara su un numero limitato di ceppi che fa venire […]
13
Nov
Nov
Questo riduce a zero la possibilità dell'errore dovuta ad interpretazione soggettiva perchè non bisogna più dire presenza o assenza di banda ma analizzare la sequenza nucleotidica. Si basa sulla variazione allelica, sulla presenza di polimorfismi anche in geni altamente conservati come gli housekeeping. Il numero di frammenti di geni housekeeping varia da 6-7-8 a seconda […]
13
Nov
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Scegliendo opportunamente il pannello di enzimi, è possibile discriminare i ceppi in studio sulla base del prodotto genico di alleli diversi, per un numero vario di loci. Questo sistema consente di valutare marker “co-dominanti” in microrganismi diploidi, un requisito di primaria importanza per studi evoluzionistici e di genetica di popolazione Estratti cellulari dei ceppi in […]
13
Nov
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l'analisi del cariotipo si esplica tramite il seguente metodo. Molecole di dimensioni maggiori a 20Kb non vengono risolte con questa tecnica. L’assenza di risoluzione deriva dal fatto che per il DNA il rapporto carica/massa è costante.
13
Nov
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La sigla sta per "amplification fragment length polymorphism" quindi amplificazione di frammenti polimorfici ottenuti con la restrizione. E' una combinazione tra l'analisi di restrizione e la PCR. Quindi prima restrizione del DNA genomico del microrganismo da tipizzare con due tipi di enzimi di restrizion e poi un'aggiunta di molecole nucleotidiche chiamate adattatori che sono complementari […]
13
Nov
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La sigla sta per "randomly amplified polymorphic DNA" • Amplificazione del DNA genomico “casuale” • Non è richiesta alcuna conoscenza “a priori” del genoma del microrganismo da tipizzare • Sequenza primer (un solo primer che dovrà legarsi ad entrambi i lati si lega sia in forward che in reverse) arbitraria molto corta, oligo 10 nucleotidi, […]
11
Nov
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• dopo aver isolato il DNA genomica • digerisco tutto il genoma con enzimi di restrizione • migrazione elettroforetica Ha dei limiti perchè non riesco a distinguere bene i profili (bande tutte vicine vicine) con tutto il DNA genomico, quindi posso fare un RFLP riducendo il numero di bande trasferendo su un filtro di cellulosa […]
Parto dalle sequenze ITS che sono in banca dati. Si sceglie uno stretch di 30-35 paia di basi all'interno dell'ITS per ciascuna specie che sarà spottata sul vetrino. Facciamo in modo tale che la nostra sonda termini sempre una base prima dell'incorporazione della timina (si usa la tecnica APEX).
• Gene presente in tutti i batteri • Sequenze conservate • Regioni di eterogeneità • Database completo ed affidabile